之空手套白狼

近年来涌现出不少仪器和试剂,让PCR的速度越来越快。尽管这些工具让我们省了不少心,但拥有快速PCR仪的实验室并不多,快速PCR酶也没有普及,我们只拥有普通的PCR仪和酶,但又想PCR做得更快一点,那也并非异想天开。在本文中,就让Bio-Rad的专家来告诉你如何空手套白狼,以最少的投入让PCR加快3-4倍。

最初的变性

PCR反应的最初步骤是在94-96℃孵育2-20分钟。这个步骤将最初的模板变成单链,并激活热启动的聚合酶。但是即使是对全基因组DNA而言,只要94-95℃ 2-3分钟也可以完全变性。有些热启动的聚合酶需要15-20分钟才能达到最大活性,但如果选择抗体修饰的热启动酶,比如iTaq,只需98℃ 15-30秒就能完全激活。

循环中的变性

PCR循环中的变性时间就没有最初那么严格了,因为变性的模板只是PCR产物,它比初始模板短得多,也简单得多。Bio-Rad的专家用iQ supermix试验过,只要在92℃变性1秒钟就足够了,对产物几乎没有影响,包括GC含量高达83.5%的产物。这与Yap和McGee(1991)的结论一致,他们认为500bp以下的PCR产物就根本无需92℃的变性。

退火和延伸

由于许多DNA聚合酶在很宽的温度范围内(55-72℃)都具有高活性,所以PCR的退火和延伸也可以压缩成一个步骤。少了一个步骤,时间自然也节省了不少。在大部分情况下,标准的退火时间(15-60秒)和延伸时间(1 min/kb)其实是过长了。引物与模板是高度同源的,因此在适当的温度下只需要几秒钟就能完成退火。一些优化好的反应体系也能有效节省延伸时间。例如使用iTaq,15秒的退火/延伸对500bp的产物而言就足够了。

优化退火/延伸的温度对PCR反应来说还是十分重要的,因为它决定了反应的特异性。如果退火

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温度太高,引物不能有效退火,会导致无产物或产量低;如果太低,引物错配,非特异扩增又会出现,质量大打折扣。为了最大化速度和特异性,应使用不牺牲产量的最高退火温度。这时就需要一台梯度PCR仪来帮忙了。

特别提示:如果你要为快速PCR反应重新设计引物,利用引物设计软件(如Primer3)将会是一个很好的选择。你只需设定想要的引物Tm值就行了。利用现成的引物也可以,只要在5’端多加2-4个碱基。不过,你还要确认一下这样做是否产生了新的错配或自身配对。

最后的延伸

一般来说,PCR最后的延伸步骤都是70℃

5-10分钟。尽管它被称之为延伸步骤,但是主要还是为了让PCR产物退火形成双链,以便用于克隆或电泳。Bio-Rad的专家把时间缩短到30-60秒,发现它对100-1000bp的PCR产物几乎没什么影响。

循环数

起始模板浓度高的话,PCR的循环数小于20都是OK的。但如果靶DNA的拷贝数低(如100个拷贝),那必须做35个循环才能产生足够的产物,在电泳中检测到。起始模板越少,模板就应该相应增加。实际上,很多时候我们不清楚模板的量有多少,那么为保险起见,最好还是做35-40个循环。

快速PCR专题到此结束。如果大家还有什么独家秘籍,欢迎与我们共享。

(生物通 余亮)

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