培养基的配制

培养基的配制:实验步骤:在超净台内,安装好滤器。用去离子水溶解1640培养基,并用磁力搅拌器搅拌2 h,使之充分溶解。在超净台内过滤。分装到250 mL的玻璃瓶内。用封口膜封好,-20℃保存,过滤结束时,还要取少许培养基进行菌培,验证培养基是否是无菌。胎牛血清的处理:没有灭活的血清中含有补体成分,需要将血清在56℃条件下灭活30 min。在水浴锅内进行,灭活的过程中,要不停地摇晃,使受热均匀,防止沉淀析出来。注意:刚取出的冻存血清不要立即放入56℃中,因为突然的温度升高会使装血清的玻璃瓶破裂,应该放在室温逐渐溶解,然后,再进行灭活处理。生长培养基的配制:90 mL IMDM中加入大约10 mL的胎牛血清(10% 左右),双抗可以不加。(有资料表明双抗对细胞有一定的毒副作用)Hanks 和D-Hanks液,以及胰酶的配制Hanks液是一种常用的平衡盐溶液,D-hanks液是不含钙镁的Hanks液。它们与细胞的生长状况下的pH值和渗透压一致,细胞在Hanks液中可生存几个小时,Hanks液主要用于清洗细胞。D-Hanks液主要用于配制胰酶。配制Hanks液需将CaCl2溶于蒸馏水,再将其它试剂配制成溶液,将两次配制的溶液混合,定容。胰酶是一种常用的细胞消化液,在原代培养时,用胰酶消化,使细胞从组织块中游离出来。传代培养时,用胰酶消化贴壁的细胞,并分散成单个细胞。胰酶分离细胞的能力与不仅与胰酶作用的温度、时间、浓度和pH有关,还与细胞的类型和特性有关。用于原代培养消化组织块采用的浓度为:0.1% 或 0.125%;用于传代培养采用的胰酶浓度为:0.25%或者0.2%。

胰酶的配制:1)由于胰蛋白酶的作用主要机制是通过螯合钙镁离子,而钙镁离子是保持细胞和细胞之间相互连接所必需的,所以,胰酶的配制用无钙镁的D-Hank液,避免钙镁离子干扰胰酶的活性。2)胰酶在pH8.0时活性最强,在过滤除菌前,须用NaHCO3干粉调溶液的pH值。3)胰酶受热容易分解,所以避免盛夏配制,在配制过程中,温度保持在4℃,最后-20℃冻存。反复冻溶会影响胰酶的活性,要分装冻存。4)血清能降低胰酶的活性,所以,在终止胰酶的消化反应时,可加入含有血清的培养基。[实验步骤]配制Hanks液,高压灭菌,4℃保存。称取胰酶,在冰浴上进行研磨,并加入少量的D-Hanks液,使其呈糊状,最后用D-Hanks定容,过滤除菌。分装后,-20℃保存。

细胞传代培养[实验步骤]

1、准备工作:1)肥皂洗手,在进行无菌操作前,用75% 的酒精擦拭双手,注意指间,和指甲周围。同时,用酒精棉球擦拭超净台。2)将培养液?放置室温,备用。3)打开超净台内的紫外灯,照射20 min。同时,将实验所需材料也放入超净台进行灭菌(血清、培养基?除外)4)倒置显微镜下,观察细胞的状态,是否已经长满培养瓶,需要进行分瓶。

2、关闭超净台的紫外灯,打开风机。

3、点燃酒精灯,取出刻度吸管,在火焰上略烧,然后,安上吸球待用。 4、在打开培养瓶之前,用酒精棉球擦拭瓶盖,打开后,瓶口在酒精灯上过火焰,再用吸管轻轻吸出旧的培养液,注意,吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁。

5、将胰酶加入培养瓶内,显微镜下随时观察,见到细胞的突起消失,变圆时,立即翻转培养瓶,吸出胰酶。记住不要消化时间过长,否则,细胞会被胰酶消化掉。

6、加入适量Hanks液或培养基清洗一遍,立即倒掉。

7、加入含有10%血清的培养基,用吹打管吹打,一定要轻轻吹打,使其从瓶壁上脱落分散到培养基中,再补加培养基,按1:3进行分瓶。然后,用火焰烧培养瓶的瓶口和盖,再盖好培养瓶的盖,放到培养箱中进行培养。以上介绍的是贴壁细胞的传代培养方法,对于悬浮细胞的传代培养方法,只需要将细胞进行离心,1000 rpm,5 min,然后,换入新的培养基即可。

再分装到不同的培养瓶中进行培养。不健康的细胞质中有空泡,细胞内有颗粒样物质,细胞间空隙增大,变形,不规则,失去原有的特点。4. 是否污染:传代或换液24~ 48 h注意观察细胞是否被污染,污染的细胞培养液变浑浊,镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢,生长特性改变,胞质内颗粒性物质增多,尽管培养液不变浑浊,考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走,以免污染其它细胞。

细胞冻存与复苏[实验步骤]

1. 为了保证细胞良好的状态,在细胞冻存的前一天使细胞处于对数增长期,同时将细胞换液,次日,按照细胞传代培养方法,用胰酶消化贴壁细胞,将细胞用培养基冲下来,然后,用50 mL尖底离心管离心,1000 rpm,4min,弃上清,收集细胞。

2. 加入适量的冻存液(10% DMSO 和 90%含有20%血清的IMDM培养基)

3. 分装到冻存管中,做好标记,标明细胞名称,保存时间,所用培养基等。

4. 4℃放置30 min;-20℃放置1.5 h; -70℃放置12 h;最后移到液氮罐中。

细胞的复苏:细胞的复苏原则是快速溶化,因为如果缓慢的溶化,会使进入细胞的水分形成冰晶,对细胞造成伤害,因此,在复苏细胞时,将冻存细胞直接放到37℃的水浴中,使其迅速溶解。在超净台内将冻存管内的细胞悬浮液直接倒入小培养瓶或培养皿内,然后,加入3 mL的培养液。次日,观察细胞生长情况,并更换细胞培养液。


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